پشكنینی Gram stain چۆن ئه‌نجام بده‌ین ؟

سەرەتا پێش ئەوەی باسی پشکنینی گرام ستەین بکەین پێویستە هەندێ زانیاریمان هەبێت لەسەر دیواری خانەی بەکتریایی گرام پۆزەتیڤ و گرام نێگەتیڤ بەکتریا چونکە ئەم پشکنینە بە تەواوی پشت بە دیواری خانە دەبەستێت.

دیواری خانەی گرام پۆزەتیڤ(+) بەکتریا و نێگەتیڤ(-) بەکتریا: 

دیواری خانەی گرام پۆزەتیڤ بەکتریا بە شێوەیەکی سەرەکی پێک هاتووە لە peptidoglycan، ئەم پیپتیدۆگلایکانە ٪٩٠ دیواری خانە پێک دێنێت ، دیواری خانە پێکهاتەیەکی رەقی هەیە بەهۆی یەکگرتنی

 NAM tetrapeptid لەگەل peptid ەکان.

 

هەروەها دیواری گرام پۆزەتیڤ بەکتریا  (teichoic acid )و( glycopolymer)ی تێداییە وە نوقمی

پیپتیدۆگلایکان بوونە رۆلێکی سەرەکی هەیە لە دابەشبوونی خان ، بارگاوی کردنی خانە ، چالاک کردنی

Proton motive force, پێدانی شێوە بە خانە.

هەروەها teichoic acid رۆلێکی سەرەکی هەیە لە پاراستنی خانە لە پلەی گەرمی بەرز و چری خوێی زۆر ، گروپی ئنتیبایۆتیکی ( B-lactam ). پیپتیدۆگلایکان دەنووسێت بە پەردەی خانە لە رێگایی چەوری بویە بێی دەلین lipoteichoic acid .

exoenzyme دروست دەکات لەناو سایتۆپلازم دواتر دەگوازرێتەوە بۆ پەردەی خانەوە لە رێگایی دیواری خانە فرێدەدرێتە دەرەوەی خانە بۆ تێکشکاندنی مولیکولەری گەورە .

 

 

دیواری گرام نێگەتیڤ بەکتریا ئالۆزترە لە گرام پۆزەتیڤ، پیپتیدۆگلایکانی تێداییە و لە دوو چینی پەردە پێکدێت،  پەردەی ناوەوە، پەردەی دەرەوە outer membrane پێکهاتووە لە (lipid bilayer ) لە رووی پێکهاتە زۆر لە cell membrane دەچێت تاکە جیاوازی بوونی (LPS )لە outer membrane،

 

هەروەها ( LPS) پێکدێت لە سی بەش یەکەم O-antigen دووەم core polysaccharides سێیەم Lipid A، کە چەقیون لەناو (OM).

LPS چەندەها فرمانی گرینگ بۆ خانە جێبەجێ دەکات لەوانە جێگیرکردنی پەردەی دەرەوە، پاراستنی خانە لە ماددە کیمیایەکان، پاراستنی لە pathogenic ەکان،

 Lipid A کاردەکات وەکو endotoxin کە دەبێتە هۆی سکچوون و تا، لەجیاتی exotoxin کە لە گرام پۆزەتیڤ هەیە بەلام لە گرام نێگەتڤ periplasmic enzyme ی هەیە بۆ شکاندنی دەنکۆلە گەورەکان.

هەروەها porin بەکاردێنێت بۆ ئالوگۆرکردنی ماددەکان لە ناوەوە و دەرەوەی خانە.

پیپتیدۆگلایکان بەستراوە بە outer membrane بەهۆی .(Lipoprotein)

 

LPS= lipopolysaccharides

NAM= N-acetyl muramic acid

OM= outer membrane

 

 

Gram stain

دوایی زەرع کردنی بەکتریا و گەشە کردنی لەسەر میدیا دەست دەکەین بە دیاریکردنی بەکتریایی گرام پۆزەتیڤ و گرام نێگەتیڤ بەکتریا.

گرینگترین شت سەرەتا هەلکردنی ئاگرە(bunsen burner) بۆ ئەوەی دوور بیت لە پیس بوونی سامپلەکەت بە بەکتریای تر پاک کردنەوەی شوێنی ئیشکردنەکەتە.

دواتر سلایدێکی پاک دەهێنین کە پێشتر کاری پێ نەکرابێت، دواتر سوود لە لووپ(loop) وەردەگرین بۆ گواستنەوەی بەکتریاکە بێگومان پێش ئەوەی لووپەکە نزیکی بەکتریا بکەین پێویستە لووپەکە پاک بکەینەوە ئەویش بە راگرتنی بە پلەی ٤٥ لەسەر ئاگرەکە بۆ ماوەی خولەکێک یان زیاتر، دواتر چەند چرکەیەک ئەوەستین تاکو لووپەکە سارد دەبێتەوە.

یەک دلۆپ ئاوی پاک(distilled water) دەگوازینەوە سەر سلایدەکە، دواتر لە رێگایی لووپەکە یەک تۆز بەکتریاکە دەگوازینەوە سەر سلایدەکە و تێکهەلی دەکەین لەگەل دلۆپە ئاوەکە بە شێوەی بازنەی لەسەر سلایدەکە.

دوایی ئەوە کەمێک ئەوەستین تاکو سلایدەکە وشک دەبێت، پاشان سێ جار سلایدەکە بەسەر ئاگر ئەهێنین و ئەبەین(Fixation) بۆ ئەوەیە بەکتریاکە چەسپ بێت بە سلایدەکە و لەکاتی بۆیە کردن لێ نەبێتەوە بە هەموو ئەو کردارانە دەگوترێت ئامادەکردنی سمیر.

دواتر پێوەیستە سلایدەکە بۆییە بکەین بۆ جیاکردنەوەی گرام پۆزەتیڤ و گرام نێگەتیڤ، پێویستە سێتی گرام ستەین بەکاربێنین، سێتی گرام ستەین لەچی پێک هاتووە؟ هەر سێتەوە و کەتەلۆکی خۆی لەگەلە بەلام بە شێوەیەکی گشتی بەم شێوەیە ئەنجام دەدرێت.

یەکەم بۆیە بەکاریبێنین (Crystal violet) ئەم بۆییە رەنگی شین یان رەنگی مۆرێکی تۆخە، لە رێگایی سرنج یان درۆپەر یان هەر شتێکی تر کۆمەلێ دلۆپ دەگوازینەوە سەر سلایدەکە و تەواوی سمیرەکەی پێ دادەپۆشین بۆ ماوەی دوو خولەک، ئەم crystal violet دەچێتە ناو دیواری خانە(Cell wall)ی بەکتریاکە لەوێ جێگیر دەبێت، دوایی دوو خولەک لە بۆییە کردن سلایدەکە دەشۆرین بە ئاوی پاک بەلام وا باشە ئاوەکە بە شێوەی دلۆپە بێت.

 

دووەم بۆییە بەکاریبێنین (iodine) ئەم بۆیە سوورێکی کالە بۆ ماوەی یەک خولەک بەسەر سمیرکە دادەکەین، دواتر ئەم (iodine)ە یەک دەگرێت لەگەل crystal violet و بەندێک پێک دێنن، دوایی یەک خولەکەکە سلایدەکە بە هەمان شێوەی دلۆپ دلۆپ دەشۆین.

 

دواتر کهول بەکاردێنین بۆ ماوەی ١٥ چرکە، ئەگەر هاتوو بەکتریاکە گرام پۆزەتیڤ بێت ئەوا کهولەکە کاریگەری لەسەر بۆییەکانی ناکات و ناتوانێ بۆییەکە بێنێتە دەر لە دیواری خانە، بەلام ئەگەر گرام نێگەتیڤ بوو ئەو بۆییەی چۆتە ناو دیواری خانە رێک لەگەل خۆی دێنێتەوە دەرێ، ئەمەش بۆ ئەوە ئەگەرێتەوە پیپتیدۆگلایکانیان جیاوازە، دوایی ١٥ چرکەکە بە هەمان شێوە سلایدەکە دەشۆرین.

 

چوارەم بۆییە (Safranin) ئەم بۆییە رەنگی سوورێکی تۆخە بۆ ماوەی یەک خولەک لەسەر سمیرەکە دادەکەین و دواتر دەیشۆین، ئەو بەکتریایانەی لەسەر سلایدەکە هەن ئەگەر گرام پۆزەتیڤ بوون ئەوا ئەو بۆییە وەرناگرن چونکە تەواوی دیواری خانەیان دەپۆشراوە بە Crystal violet ئەو بۆییە شوێنی نییە تاکو بچێتە ناوی، بەلام ئەو بەکتریایانەی گرام نێگەتیڤن ئەو بۆییە وەردەگرن چونکە هیچ بۆییەک لەناو دیواری خانەیان نەماوە، بە هەمان شێوە سلایدەکە دەشۆرین.

دواتر چاوەرێ دەکەین تاکو سلایدەکە وشک دەبێتەوە، ئەیخەینە ژێر مایکرۆسکۆپی ئاسایی بە لێنسی ٤٠ فیلدەکە دەدۆزینەوە، و دواتر بۆ ئەوەی جوانتر بەکتریاکان ببینین ئەوا لێنسەکە دەگۆرین بۆ ١٠٠، لە لێنسی ١٠٠ پێویستە (Oil immersion) بەکاربێنین بۆ ئەوەی رووناکی مایکرۆسکۆپ تووشی شکانەوە نەبێت.

پشکنین بۆ فیلدەکە دەکەین ئەگەر هاتوو بەکتریاکان بە شێوەی مۆر یان شینێکی تۆخ دەرکەوتن ئەوا گرام پۆزەتیڤ<+> بەکتریایە، بەلام ئەگەر بەکتریاکان بە شێوەی سوور دەرکەوتن ئەوا گرام نێگەتیڤ<-> بەکتریاییە.

شێوەی بەکتریاکن هەیانە گۆییە(خرە) هەیانە چیلکەییە هەیانە لوولپێچە، شێوەی بەکتریاکان بە جۆری بەکتریاکن دەگۆرێت.

 

·        Crystal violet (2 min)

·        Iodine (1min)

·        Alcohol (15 sec)

·        Safrannin (1min)